中国间充质干细胞药物开发流程（上篇）

近年来，我国不断更新对 MSCs 产品作为药物管理的规定。本文重点介绍 MSCs 产品开发过程中面临的流程和监管挑战，旨在提供满足监管需求的策略。

本文重点介绍了中国异体间充质干细胞药物开发的全过程，包括法规、指南、工艺、质量管理、IND 前会议和 IND 申请以便获得临床试验许可。

01 间充质干细胞基本情况

MSCs 来源广泛，包括骨髓、脂肪、牙髓、脐带、胎盘、羊膜、子宫内膜组织、脐带血、外周血、角膜缘等人类组织。回顾过去二十年，MSCs 由于其抗炎、促进血管生成、免疫调节以及在特定条件下的多系分化能力，已成为临床治疗最有前景的候选细胞之一。MSCs 具有免疫豁免属性，给药前不需要 HLA 匹配。从少量的起始生物材料开始，大规模扩增相对容易。体内研究已经很好地证明了 MSCs 的疗效、有效性和稳定性，以支持潜在的临床应用。

全球有800多项已注册的 MSCs 药物临床研究和 55000 多份 MSCs 相关文献。目前，人们越来越需要了解 MSCs 作为药品开发相关的法规问题。大多数 MSCs 产品符合国际细胞治疗协会（ISCT）在2006年定义的 MSCs 的最小标准，包括细胞表面标记物（即 CD105、CD73、CD90）的高表达，与造血细胞相关的标记物（如 CD45、CD34、CD14、CD19 和 HLA-DR）的低表达，以及三系分化潜能。细胞标志物在描述给定适应症的 MSCs 细胞产物时缺乏特异性。尽管世界上大多数监管机构不要求将纯化的 MSCs 作为临床产品，但在 MSCs 产品的开发过程中考虑细胞标志物时，需要确定一致性和纯度。

在美国，根据《公共卫生服务法》（PHS法案；42 U.S.C.262）第351条，培养和扩增的MSC产品需要向美国食品药品监督管理局提交IND申请，以获得进行临床试验的许可。在欧盟，基于MSC的治疗产品的开发和授权由欧洲药品管理局（EMA）监管。EMA成立了高级治疗委员会（CAT），负责审查和许可MSC治疗产品。在中国，根据现行监管规定，MSCs在临床研究中的使用可以通过两个渠道获得许可。一是卫生健康委落实细胞治疗产品临床研究相关规定，批准通过伦理委员会审核的定点医院开展MSCs临床研究。其次，如果申请人打算开发MSCs药物，使用MSCs产品的临床试验需要根据NMPA法规获得CDE监管的IND申请和许可证。IND申请必须由申请人提交，并提供全面的信息（包括细胞和制造工艺的开发、质量标准、质量控制、MSCs产品的稳定性研究、药理学研究、安全性和毒性研究，以及临床试验计划和方案）。根据IND申报规定，MSC产品必须在符合GMP的实验室生产。

本文有助于 MSCs 产品开发人员熟悉获得IND申请许可的流程和监管问题。

02 间充质干细胞产品开发流程

一般来说，MSCs 治疗产品的开发包括几个关键阶段，如下所示：

• 基础研究包括：MSCs 的分离、纯化、细胞特性分析、细胞培养基的开发、扩增和拟定适应症的作用机制（MOA）。

• 药学研究主要包括：化学生产控制、产品检测与放行、稳定性程序等。 

• 药理学研究主要包括：确定目标适应症，巩固预期的作用机制，确定给药途径，确定生物活性剂量，确定疗效，证明安全性和药代动力学，等等。

• 毒理学研究应考虑：单剂量毒性试验、重复给药毒性试验、致瘤性研究、遗传毒性试验、生殖毒性试验、抗原性试验、免疫毒性试验和局部耐受性等。

• IND 申请包括 IND 前会议、IND 申报材料撰写和 IND 提交。

• 临床试验包括探索性临床试验和验证性临床试验。

注：间充质干细胞（MSCs）产品开发流程图

03 适用于间充质干细胞产品的法规和指南

所有供人使用药品的开发都要求生物技术公司符合必须遵守的法律要求。

• 在美国，MSCs 和其他细胞药物由美国食品药品监督管理局生物产品评估与研究中心（CBER）监管，特别是细胞组织和基因治疗办公室（OCGTT），该办公室根据《美国联邦法规》第 21 卷第 1271 部分规管人类细胞、组织、细胞和基于组织的产品。

• 在欧盟，MSCs 和其他细胞药物属于先进疗法（ATMP）的范畴，包括体细胞治疗药物、基因治疗药物和组织工程产品。

• 在日本，自 2014 年以来，人类细胞、基因或组织来源的医疗药物一直受到《药品和医疗器械法案》（PMD 法案）的监管。

• 在中国，最早以《中华人民共和国药品管理法》为指导，于 1984 年全国人民代表大会首次颁布并于 2019 年进行了修订。随后，国家药品监督管理局依法成立。NMPA 负责制定药品质量标准、药品管理条例和安全监督管理。NMPA 已经建立了一个药物审评中心（CDE），用于药物审查和评估。中国所有的细胞治疗，包括干细胞产品、免疫细胞产品和基因修饰细胞产品，均可参考 NMPA  2017 年发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》规范。

2020 年 4 月 26 日，NMPA 更新了《药品生产质量管理规范（GMP）》的生物制品附录。NMPA 还起草了《药品生产质量管理规范（GMP）》（征求意见稿）中的细胞治疗产品附录。2020 年 8 月 4 日，NMPA 还起草了《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则（征求意见稿）》。新药的开发还必须符合现行《中国药典》和其他国家药品标准。此外，2017 年，NMPA 作为新成员加入了国际人用药品注册技术协调会（ICH），ICH 发布的所有指南都将获得 NMPA 的批准。

因此，药品开发企业可以参考 ICH 指南。有关细胞治疗的更多信息，请参阅美国FDA、欧盟 EMA、美国注射剂协会（PDA）、美国的人体细胞组织优良操作规范（GTP）和国际制药工程学会（ISPE）的相关法规和指导文件。

04 化学、制造和控制（CMC）

一、质控体系的建立与实施

GMP 是一种质量保证体系，用于确保 MSCs 产品的持续生产和控制符合适用于临床的最先进的质量标准。因此，临床级 MSCs 应遵循 GMP 指南，并按照 IND 法规和质量要求生产药物。GMP 原则是为消费者和患者提供质量一致、安全性高的产品。为了满足这些原则，制造商必须建立、实施和维护药品质量体系。药品质量体系应监督所有活动（从原材料进厂的控制、生产、测试、人员、设备、标识、生产记录审查、错误检测和纠正以及产品最终放行的授权）。确定并实施适当的产品质量改进、工艺改进、可变性降低、创新和药品质量体系改进，以增强持续满足药品质量要求的管理能力，质量风险管理有助于确定持续改进的方向和优先级。

临床级 MSCs 产品的生产依赖于训练有素且符合岗位要求的员工，这是 GMP 质量体系的重要组成部分。中国 GMP 的期望是，参与生产和管理各个方面的员工将接受系统的教育、持续的培训和定期的评估。负责人应具有具体的职责和充分的授权来履行其职责。此外，《药品生产质量管理规范（GMP）》的附录《细胞治疗产品（征求意见稿）》对关键员工的资质要求更高、更详细，包括产品生产负责人、质量负责人和质量受权人。

MSCs 产品生产环境和设施的空气清洁度水平应适合产品和生产操作，生产环境和设备不应对原材料、中间体和成品造成污染。MSCs 产品的生产环境和设施应易于清洁和消毒。此外，有必要对 MSCs 产品的生产环境和设施进行持续监控。MSCs产品生产环境和设施的清洁、消毒、维护和监控操作必须定期验证并持续控制。生产设备的设计、定位和维护应符合其预期目的和用途。生产、测量、称重、记录和控制设备应在规定的时间间隔内通过适当的方法和合格的机构进行维护、校准和检查。
CDE 主要通过申请人的文件系统获得 GMP 合规性。这必须涉及操作和质量管理的各个方面，以便能够审计与产品制造和质量控制相关的所有活动。此外，《药品GMP》（2010 年修订）第 8 章规定，文件是质量保证体系的重要组成部分，生产企业必须有书面的管理程序、质量标准、技术指南、制剂处方和工艺规程、标准操作规程，并准确记录内容。企业应建立管理和操作程序的文件管理程序，包括文件的系统设计、编制、审查、批准和发布。质量管理部门应审查与本规范有关的文件。文件内容应与药品生产许可证和药品注册的相关要求一致，并有助于追溯每批产品的历史记录。

二、物料管理

材料是指用于制造 MSCs 产品的原料或材料（包括细胞、平衡盐溶液、蛋白酶、血清、培养基、细胞因子、各种添加剂、冷冻保存试剂、转基因材料、辅料、培养瓶、细胞冷冻保存袋等）。生产物料与 MSCs 产品的质量直接相关，因此，物料管理必须建立在良好和标准化的质量保证和评估体系的基础上（包括风险评估、关键材料制造商和供应商的资格审查、质量放行测试的开发和改进等）。物料的来源、成分、用途、用量和质量控制应清晰合理。在选择材料时，应考虑必要性、合理性和安全性，并开展工艺去除效果验证和安全风险评估，如有必要，应对材料残留进行测试放行。优先使用已被批准供人类使用或符合药典标准的材料是非常重要的。对于生物来源材料（如 FBS 和人白蛋白），应对外源因子进行全面检查，并在技术开发中考虑新外源因子的知识。使用自体细胞治疗产品应严格防止外源因子扩散的可能风险，材料管理信息应在 IND 应用程序的 CMC 部分提供，CDE 评审员将确定制造的适用性。

• 原料

  用于分离和培养MSC的生物材料均来自捐赠者，需要签署医院医学研究伦理委员会批准的知情同意书。每个捐献者都需要接受人源病原体的筛查和检测，尤其是HIV、HBV 和 HCV。培养扩增所需的所有起始材料和试剂都需要进行测试，以证明这些材料是无菌的，不含内毒素。

  细胞分离和培养扩增过程应在 GMP 条件下进行，并进行验证以建立主细胞库（MCB）。需要同时实施质量控制，以确保储存在主要细胞库中的细胞经过无菌、支原体和内毒素检测和监测。因此，有必要建立明确的标准和要求（如细胞表面标记物、培养条件的优化、细胞运输量、生长特性等）。原则上，对于从适合建立主细胞库的生物材料中分离原代细胞，并有计划进行细胞检测、保存和制造。细胞库的水平可为根据细胞自身特点、生产状况和临床应用综合考虑建立细胞库检验标准，检验应满足安全性、质量可控性和/或有效性的基本要求。

• 辅料

  应开发和验证 MSCs 产品中辅料的使用、剂量和质量，以证明其使用的必要性、安全性和合理性。建议优先选择已批准用于人类药物的辅料。否则，辅料的选择需要进行全面的研究和评估。此外，一个更好的选择是在产品 IND 申请审查过程中对关键辅料进行相关审查和批准。

• 容器和封闭系统

  为了避免产品质量因储存而发生意外变化，生产商应在 MSCs 产品生产过程中对用于样品储存和/或成品的包装容器和封闭系统进行安全评估和兼容性研究。为了说明其包装容器和封闭系统使用的合理性，还需要研究其密封和冷冻储存的适用性。MSCs 产品的生产过程（如收集的组织或细胞、制备过程中的细胞、成品的输注等）可能涉及样品和容器之间的短期直接接触。生产商还应进行接触式容器系统和 MSCs 产品之间的安全评估和兼容性研究。此外，建议在 IND 审查期间审查和批准与药物直接接触的容器和封闭系统。

三、GMP 车间的 CMC

由于细胞在体内存活、自发增殖或/和分化的能力，临床研究和质量控制应充分考虑上述基本特征。MSCs 产品应符合药品质量管理的一般要求。临床样品的整个生产过程是合理的，符合《药品生产质量管理规范（GMP）》的基本原则和相关要求。在生产过程和质量控制中应特别注意人员、环境、设备和其他要求。MSCs 产品的制造应建立一个贯穿整个过程或生命周期的质量保证和控制系统。生产过程应经过严格的工艺验证，并建立明确的关键控制点。严格控制生产材料，建立并验证 MSCs 产品生产现场的标准操作程序，以避免生产过程中原材料和生产的潜在外部或交叉污染。还应采取有效的隔离措施，防止不同供应商的产品或预期用途混淆。

• 制造

  MSCs 产品的生产过程是指从供体材料中获得细胞到完成细胞输入受体体内的体外操作。制造商必须进行工艺开发和验证，以证明工艺的可行性和可靠性。生产过程中的每一步都需要进行控制，以确保成品符合包括规格在内的所有质量属性。

  工艺验证是指从工艺设计阶段到商业生产的数据收集和评估。它建立了科学的证据来证明该过程可以持续交付高质量的产品。工艺验证包括 MSCs  产品和工艺生命周期内发生的一系列活动。工艺设计应避免细胞发生意外或异常变化，并满足消除相关杂质的要求。制定技术标准、工艺标准操作规程、关键工艺控制参数、内部控制指标和废弃物标准，并对整个生产过程进行监控。制造商应继续优化生产工艺，减少物理、化学或生物效应对细胞特性的意外影响，并减少杂质（如使用蛋白酶、核酸酶和选择性抑制剂）。如果在制造过程中存在不连续生产，则应确定并验证电池的储存条件和持续时间。建议使用封闭或半封闭制备工艺，以降低污染和交叉污染的风险。

  监控整个生产过程，包括监控关键工艺参数（CPP）和实现过程控制指标。制造商应根据对整个过程的理解和积累的产品经验，明确过程控制中的关键生产步骤，并建立有限的敏感参数范围，以避免过程漂移。如有必要，还可以在生产过程中对细胞进行质量控制。生产过程中的质量控制和细胞放行检测是相互结合和互补的，以实现对整个过程和产品质量的控制。由于供体材料的多样性，它们可能含有传染病病原体，并且这个过程可能会造成污染。应特别注意在 MSCs 产品的整个制造过程中防止微生物污染。

  MSCs 产品的剂型、处方和处方工艺应根据临床用药要求和 MSCs 产品稳定性确定。一些 MSCs 产品在给药前需要经过改变产品成分的物理状态、容器转换、过滤和清洁、与其他组织材料结合以及调整药物剂量等步骤。因此，还应开发和验证这些工艺步骤，并在实际产品生产和应用中严格执行。应提供  MSCs 生产中使用的组份和材料的制造信息，以及对这些材料进行的检测汇，应提供制造过程中使用的所有组份的清单。对于异基因细胞，供体筛选和检测信息应表明所有供体都符合供体标准，并且必须提供关于 MSCs 组织来源和分离、大规模扩增以及收集培养的详细说明。细胞库部分应提供有关历史、来源、衍生和特性的信息（包括确定细胞安全性、特性、纯度和稳定性的测试）。

  在申请 IND 时，必须列出所有用于细胞生产的试剂信息（包括基础培养基、细胞因子、生长因子、抗生素、胎牛血清、缓冲液和蛋白酶等）。这些试剂可能会影响最终产品的安全性、有效性和纯度，通常是外源性的。因此，应控制和证明其来源、质量、鉴定以及从最终产品中去除。制造商的质量检验报告（COA）、质量标准和申请人的 COA 必须是材料管理的最重要信息之一。还应列出最终产品中存在的辅料，并详细解释生产程序，并提供细胞产品的分离、传代、纯化、大规模扩增、收集、制备、包装和最终产品检测的流程图。此外，还应详细说明细胞的制备、工艺时间、中间储存和最终配方。

• 产品测试和放行

  MSCs 产品的质量研究应贯穿整个开发和规模化生产过程，从具有代表性的产品批次和适当的生产阶段中选择样品。质量研究应涵盖各种细胞分析，包括功能、纯度和安全性，并可根据产品特性和属性增加其他相关研究项目。制造商必须制定 MSCs 产品的质量标准和质量控制策略，这些标准和策略应符合 NMPA 批准的药品质量标准，即药品注册标准。药品注册标准应符合现行《中国药典》通用技术要求，且不得低于现行《中国药典》的规定。如果申报的注册品种所涉及的检测项目和指标不适用于现行《中国药典》，生产商应提供充分合理的支持数据，建议使用将中间样品质量检验与最终产品放行试验相结合的机制。

  MSCs 产品的分析程序和方法必须经过系统验证和确认，申请人应提交分析程序和方法验证和验证数据，以支持 MSCs 细胞库和 MSCs 产品的鉴定、活力、质量、纯度和效力的文件。为了达到预期目的，分析程序和方法的典型验证特性应考虑以下因素：准确度、精密度（包括重复性和中间精密度）、特异性、耐用性、检出限、定量限、线性和范围。分析报告应包括原理、设备、操作参数、试剂、参考标准和材料、验收标准、样品制备、稳定性、标准制备、试验程序、系统适用性、计算、数据分析和结论。在 MSCs 产品的生命周期内，如果原材料、生产工艺、法定分析程序、国家标准和自行开发的分析程序发生任何关键变化，强烈建议重新验证。此外，当制造商提议用替代分析程序取代经验证的分析程序时，或者当分析程序从一个实验室转移到另一个实验室时，要求采用具有可比性的分析方法。目前，分析方法验证的主要挑战是中国甚至世界各地标准品和参考品的严重短缺。因此，为了解决标准品和参考品的严重短缺问题，MSCs 产品制造商与标准品和参考品开发机构之间的密切合作是必要和紧迫的。

  随着研究的进展，应逐步积累与过程相关的信息，并改进分析程序，以满足每个阶段的质量控制要求。质量控制通常应考虑鉴定试验（细胞形态、表型、细胞标记等）、生物学功效、纯度、杂质、细胞计数（活细胞计数、功能细胞计数等）、细胞生长活性、细胞周期、细胞倍增时间、克隆形成率，以及一般检测（如无菌检测、支原体、内毒素、端粒酶表达和活性等）。细胞特性研究应基于细胞类型（包括细胞形态、细胞表面标志物、基因表达、细胞分化、表面标志物表达、效价测试、分泌组定性和定量测量，以及过程中添加成分的残留量检测）。

  应根据细胞的性质、特征和预期用途，制定 MSCs 产品功能研究的分析程序。为了建立合理有效的生物功效分析程序，作用机制应与临床适应症一致。就细胞纯度而言，建议测试细胞亚群和活力。杂质研究应包括细胞加工（如蛋白酶、动物血清蛋白、重组蛋白和细胞因子）以及最终细胞产物（如死细胞残留物和其他可能的生物降解产物）。应根据细胞来源和过程的特点，考虑安全性相关研究，并可考虑外来病毒因素、细胞恶性转化的可能性、遗传稳定性、致瘤性和致瘤性。

  细胞给药过程的模拟研究还需要进一步的开发和改进。如果在医院的研究中心进行（细胞恢复、产品稀释等），申请人应制定标准操作程序，并为临床研究人员提供良好的培训。强烈建议在完成给药操作前完成标准化工艺验证测试，以验证最终产品质量（如细胞形态、细胞表型、多系分化效力、细胞数量和存活率、外观、疗效、特性、无菌性、支原体、内毒素、其他外源性物质等）。效力评估，用于证明在临床研究的所有阶段和市场批准后使用符合预定规范或验收标准的产品批次。一般来说，没有一种单一的测试方法可以完全评估预测细胞和基因治疗产品临床疗效的产品属性。因此，开发多属性测试来评估细胞和基因治疗产品的疗效是必要和可取的。

  每批产品都应进行放行检验，最终产品的质量标准应在 IND 中明确规定，通常采用表格的形式。最终放行检查数据最好在 MSCs 产品临床使用前提供。从细胞采集到临床给药，所有产品都必须具有可追溯性、可识别性和适当的标签。

• MSCs 产品的稳定性研究

  建议使用连续工艺生产 MSCs 产品。对于生产过程中需要临时储存的样品，应进行储存稳定性研究，以支持其储存条件和保质期。有必要进行稳定性测试，以证明最终细胞产物在研究所需的时间内（从最终放行到给药）足够稳定，并应注明最终产品的有效期。MSCs 产品稳定性研究的基本原则是根据产品本身的特点、临床用药需求以及储存、包装和运输的运输条件，制定合理的研究计划。应使用具有代表性的细胞样品和储存条件进行研究。此外，应制定和优化最终产品运输方案，并验证该方案的稳定性。此外，还应验证给药前的产品准备程序，以确认最终产品质量合格。

未完待续......

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