干细胞治疗的细胞代次选择

当临床应用干细胞治疗时，选择哪个代次的干细胞治疗更加合适，是经常容易被问及的。这些都是应该思考和有待解决的问题。我们都是知道，人分男女老少，而干细胞也有年轻和衰老之分，因此，细胞的代数是影响干细胞活性及临床有效性、安全性的一个重要因素。

理论上讲，细胞代数越靠前，干细胞的干性也越强。但是干细胞在体外培养的过程中，干细胞有从组织微环境到体外培养环境的一个调整和适应过程，一部分不适应的细胞会被淘汰，所以在前两三代，干细胞基因组有着不稳定的因素，可能不宜临床应用。

有研究显示，通过核型分析发现，在前三代细胞中，干细胞存在异常核型的比例偏高。就如间充质干细胞（MSC）而言，临床应用的最佳代数应该在 4~6 代。

目前临床研究中，MSC 应用较为常见的来源骨髓、脂肪、脐带、胎盘等，本文以脐带、脂肪、胎盘这三类比较常见的来源进行总结，针对不同来源间充质干细胞，体外传代培养后不同代次的一些生物学特性的变化（例如：细胞形态、细胞周期检测、表面标记物检测、染色体核型分析、相关基因表达及细胞因子的定量分析），因可供参考资料有限，不足之处请谅解。

细胞传代

体外培养时，细胞在培养瓶中的生长过程主要分为 4 个阶段（如下图）：

首先是延滞期，细胞接种到培养瓶后，起始的一段时间内是不增殖的，细胞数量保持不变。此阶段，细胞需要时间来适应新的培养环境；另外，进行细胞分裂之前，细胞内各成分（例如遗传物质）的复制与装配等也需要时间。

过了延滞期后，细胞开始分裂，进入对数生长期。此阶段，细胞数量急速增加。

细胞数量增加到一定程度时，细胞相互接触，产生接触抑制，细胞分裂生长速度减慢，直至完全停止生长，进入稳定期。

进入稳定期后，由于培养基中营养物质消耗，有害代谢产物积聚，细胞死亡数逐渐增加，进入衰亡期。

因此，为了避免大规模细胞死亡，细胞在进入稳定期时应及时消化，并重新接种到新的培养瓶中，这称为细胞传代。

从胎盘、脐带和脂肪其他组织中分离干细胞进行培养，称为原代培养，这一阶段的细胞为原代细胞（0 代）。原代细胞充满后，将细胞接种到新的培养瓶中，这是第 1 代。在第 1 代细胞长满后，将细胞接种到新的培养瓶中，这是第 2 代；第 2 代细胞充满后，将细胞接种到新的培养瓶中，即第 3 代细胞，依此类推。

胎盘间充质干细胞

足月胎盘是胎儿出生后的废物，易于获取，数量大，体积大，研究成本低，不涉及社会、伦理等问题。此外，胎盘间充质干细胞具有与骨髓间充质细胞相似的功能和特性，并且在增殖方面优于骨髓间充干细胞，可以大大增加间充质造血干细胞的数量。

一些研究分别测试了第 5、第 10 和第 15 代细胞的增殖能力。结果表明，第 5 代间充质干细胞的增殖能力显著高于第 10 和第 15 代细胞。实验结果表明，在体外培养胎盘间充质干细胞时，细胞会随着细胞代次的增加而逐渐老化。由于第 5 代后胎盘干间充质细胞的增殖能力会逐渐下降，因此最好选择第 5 代以下的间充质干细胞进行体外培养，作为临床应用。

注：胎盘间充质干细胞镜下形态

图 A 为细胞贴壁后形态均一，呈长梭形，平行或漩涡状生长（×100）；

图 B 为第 25 代细胞形态呈铺路石样改变（40×4）。

注：胎盘间充质干细胞生长曲线、增殖能力及传代结果

图 A 为第 5 代细胞的倍增时间明显短于第 10 代和第 15 代细胞的倍增时间；

图 B 为不同代次的胎盘间充质干细胞增殖能力不同，第 5 代增殖能力明显高于第 10 和第 15 代，与第 5 代比，aP<0.01，bP<0.001，与第 10 代比，c<0.05；

图 C 为胎盘间充质干细胞 5 例标本传至 25 代，无贴壁细胞或贴壁不牢，但增殖速度快。

在这项研究中，胎盘间充质干细胞可以长期传代培养到第 25 代。不同代次的胎盘间充质干细胞增殖能力不同，第 5 代的增殖能力显著高于第 10 代和第 15 代，这表明在临床应用前使用第 5 代是合适的。

脐带间充质干细胞

在各种来源的间充质干细胞中，人脐带源性间充质细胞（hUC-MSCs）作为一种更“年轻”的成人间充质造血干细胞，因其综合优势而受到越来越多的关注。

人脐带间充质干细胞的基本生物学特性，如细胞表面免疫标记物和诱导的多潜能分化潜能，在长期体外培养后没有显著变化。长期培养 20 代后，未发现致病或致瘤基因变异。高传代（P20）hUC-MSCs 与早期低传代（P5）hUC-MSCs 的细胞增殖活性和端粒酶活性无显著差异。随着培养传代次数的增加，细胞开始老化，尤其是第 20 代细胞。

注：不同代次人脐带间充质干细胞的形态学观察

hUC-MSCs 在体外培养的第 5 代和第 10 代中显示出相同的细胞形态和生长模式，显示出长梭状贴壁生长和轻微螺旋流动排列。第 20 代细胞表现出非常相似的长梭形贴壁生长，但细胞体略有扩大，融合后局部排列紊乱。

已经表明，尽管在高传代培养中 hUC-MSCs 的核型保持稳定，但在第 7 代中端粒酶活性将下降。通过检测人端粒酶逆转录酶活性亚基基因的表达，我们发现第 5 代、第 10 代和第 20 代 hUC- MSCs 的端粒酶活性没有显著差异；不同世代的细胞表现出相似的生长和增殖曲线，表明它们的细胞增殖活性没有差异。

注：不同代次人脐带间充质干细胞的增殖活性检测

总之，尽管第 20 代 hUC-MSCs 仍然保持了与低代细胞相似的干细胞的生物学特性、基因稳定性和生长特性，但随着传代培养时间的延长，细胞开始显示出一定程度的老化。鉴于过度传代导致的 hUC-MSCs 老化迹象，建议用于临床干细胞治疗的 hUC-MSCs 体外培养不应超过第 10 代。

脂肪间充质干细胞

脂肪间充质干细胞（ADSCs）是脂肪组织中的多能干细胞。它的免疫原性很低，体外扩增相对容易。这些优点使其在组织工程、创伤修复和基因治疗中具有良好的应用前景。

在一些研究中，ADSCs 在体外培养至第 1、第 3、第 5、第 7、第 10、第 14 和第 15 代。结果发现，在 ADSCs 传代至第 7 代后，细胞的增殖速率开始减慢，并且在 10 代后细胞的增殖速度显著减慢。细胞呈长梭形，保持稳定。

注：细胞形态观察

注：细胞因子定量分析

研究表明，脂肪来源的间充质干细胞（在无血清培养基中培养）的生物学和遗传特性基本稳定，在传代至第 5 代期间没有显著变化。初步揭示，脂肪来源的间充质干细胞在体外传代至第 5 代后可以安全使用。

从上述研究中不难看出，间充质干细胞在理论上可以长期传代培养，但在临床应用中不建议选择代次较高的干细胞。未在体外扩增的 MSCs 是安全无害的，除非它们有一些遗传缺陷，否则体外扩增的最大风险是基因突变。一个研究团队发现，当骨髓 MSC 在体外培养到第 18 代时，发生了基因突变和染色体异常。大量其他研究证实，只有当体外培养代数过高（超过 10 代）时，MSC 才会导致染色体异常。

影响干细胞回输安全性的另一个问题是添加剂，例如使用无血清培养基代替动物血清进行培养；通过严格的无菌操作避免使用抗生素。然而，对于细胞培养中不可替代的成分，如胰蛋白酶，在回输过程中严格检查质量以确保没有残留成分也是至关重要的。

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